Волшебные нанопули и верблюды из Черноголовки

Основной результат первой стадии — это библиотека всех вариабельных доменов (фрагментов антител) данного животного. Каждый клон — это функциональная единица, которая что-то узнаёт и соответствует реальному антителу

«Волшебные пули»

В 70-х годах прошлого века в разработке противораковых препаратов наступил переломный момент — были созданы так называемые моноклональные антитела (МАТ). За счёт того, что эти белковые молекулы обладают свойствами специфически узнавать определённый антиген или белок какой-то определённой структуры, они могут существенно более избирательно, чем традиционные химиопрепараты, воздействовать именно на целевые клетки злокачественной опухоли, заметно меньше повреждая при этом нормальные клетки организма. Не удивительно, что уже в начале 80-х годов МАТ стали называть противораковыми «волшебными пулями». Однако, несмотря на то, что фармацевтические и биотехнологические компании с тех пор вложили не один миллиард долларов в исследования, связанные с разработкой этой технологии, а целый ряд новых противоопухолевых МАТ, в том числе, антитела, «вооруженные» токсинами и радионуклидами, показали высокую эффективность, прогресс в этой области происходит довольно медленно по сравнению с ожиданиями. Мечты о «волшебной пуле» в очередной раз не сбылись, но трансформировались в более реальное представление о химиопрепаратах на основе антител как об эффективном, высокоспецифическом и относительно малотоксичном дополнительном инструменте борьбы с раком.

У этой технологии, как и у всего на свете, есть свои минусы. Во-первых, МАТ — молекулы довольно крупные и проникать внутрь клетки или глубоко в ткани они не способны. Во-вторых, для достижения необходимого результата их концентрация должна быть в 5–10 тысяч раз выше, чем концентрация молекул-мишеней. И в-третьих, МАТ вырабатываются исключительно на клеточных культурах, что делает их производство недешёвым. А в условиях импорта в России цены на эти препараты становятся вообще заоблачными. Ведь для нас их стоимость связана не только с процессом производства, но и с процедурой клинических испытаний.

Но, как оказалось, эти проблемы решаемы. По крайней мере, об этом говорят результаты проекта «Создание наноантител для эффективного контроля за патологическим неоангиогенезом, индуцированным фактором роста эндотелия сосудов», поддержанного в 2008 году Роснаукой по линии федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы».

Сергей Тиллиб: «Бельгийцы называют этот антиген-узнающий домен nanobody. Мы сначала окрестили его «мини-антитело», а теперь — «наноантитело». С одной стороны, это дань моде, а с другой — хороший эквивалент общепринятому термину»

Бельгийские nanobody на русский манер

«Идея нашего исследования возникла относительно недавно и связана с открытием бельгийских учёных, — рассказывает руководитель научной группы ИБГ РАН Сергей Тиллиб, — В 1993 году они обнаружили у представителей семейства Верблюдовых уникальные антитела упрощённой структуры, которые состояли не из четырёх цепей иммуноглобулина (двух тяжёлых и двух лёгких), а из димера только одной укороченной тяжёлой цепи. То есть, узнающий вариабельный домен этих белковых молекул формировался только одной полипептидной цепью. А это означало, что работа с ними сильно упрощает все ныне существующие рекомбинантные технологии. К тому же, эти антитела, способные специфически узнавать определённые антигены, самые маленькие из всех ныне известных белков с подобными свойствами».

На основе этого открытия была разработана новая технология, состоящая из двух частей. Сначала иммунизируется представитель семейства верблюдовых (в российском случае это были двугорбые верблюды), чтобы вызвать образование именно тех антител, которые узнают интересующие нас антигены. Потом идёт работа с молекулами рибонуклеиновой кислоты (РНК), которые, словно инструкция, несут информацию о структуре антитела. Далее, после выделения  РНК из лимфоцитов иммунизированного животного, и проводятся собственно генно-инженерные работы в лаборатории.

«Основной результат первой стадии — это библиотека всех вариабельных доменов (фрагментов антител) данного животного, — поясняет Сергей Тиллиб, — Каждый клон — это функциональная единица, которая что-то узнаёт и соответствует реальному антителу. Мы делаем библиотеку, которая многократно покрывает перечень всех возможных клонов и по сравнению с обычными рекомбинантными библиотеками в миллионы раз меньше».

С этой библиотекой, если она хранится при правильных условиях, можно работать бесконечно долго. Из неё ведётся отбор антиген-узнающих (вариабельных) доменов антител, способных аналогично полному антителу специфически связываться с заданным антигеном. «Бельгийцы называют этот антиген-узнающий домен nanobody. Мы сначала окрестили его «мини-антитело», а теперь — «наноантитело». С одной стороны, это дань моде, а с другой — хороший эквивалент общепринятому термину, — улыбается Сергей Тиллиб, — Мы их сейчас активно так называем и это, вроде бы, всех устраивает».

С наноантителами довольно просто проводить всевозможные генно-инженерные манипуляции (например, создавать более эффективные комбинированные конструкции, включающие два или несколько наноантител, а также другие белковые домены или функциональные группы)

Специфика наноантител

Как и обычные антитела, например, те же МАТ, наноантитела обладают высокой специфичностью и низкой токсичностью, но наряду с этим у них есть сразу несколько потенциальных преимуществ по сравнению с их каноническими собратьями. Эти преимущества наноантител могут быть в будущем использованы как для различного рода исследований и создания новых биотехнологических устройств, так и для диагностики и лечения болезней.

Во-первых, они имеют гораздо меньший размер (2х4 нанометра) и новые структурные особенности — лучшее проникновение внутрь ткани и узнавание того, что до сих пор не узнавалось. «Такие антитела не существуют в организме человека, и поэтому приспосабливания к ним нет. Таким образом, появляется возможность обойти ухищрения аномальных, патологических клеток и микроорганизмов, которые сумели адаптироваться к иммунной системе человека. Может быть, мы сможем нащупать слабое звено в их защите», — рассуждает г-н Тиллиб.

Во-вторых, наноантитела намного проще и дешевле производить в больших количествах. Дело в том, что после синтеза они уже функциональны и никаких дополнительных модификаций не требуют. Это позволяет сразу нарабатывать их как в бактериальных, так и  дрожжевых клетках, что делает путь создания данных белков существенно более экономичным.

В-третьих, наноантитела по сравнению с узнающими доменами традиционных антител намного лучше растворяются в организме человека и гораздо более устойчивы к значительным колебаниям температуры и кислотности (рН). По словам Сергея Тиллиба, эти антитела часто бывают экстремально стабильны. Предполагается, что многие из них могут выдерживать прохождение желудочно-кишечного тракта, что делает возможным их приём внутрь в виде обычных таблеток. К слову сказать, препараты, разработанные на основе MAT, до сих пор вводятся в организм человека в виде инъекций.

В-четвёртых, с наноантителами довольно просто проводить всевозможные генно-инженерные манипуляции (например, создавать более эффективные  комбинированные конструкции, включающие два или несколько наноантител, а также другие белковые домены или функциональные группы). Также, их по сравнению с обычными антителами легче гуманизировать, то есть приспособить для использования в человеке.

Все эти преимущества открывают широкое поле применения наноантител в качестве основы лекарственных препаратов нового поколения для широкого спектра заболеваний.

Двугорбые верблюды — наше всё

В природе в норме такие наноантитела встречаются только у представителей семейства Верблюдовых и некоторых видов акул. «Но, как понимаете, с акулами работать весьма проблематично, — усмехается Сергей Тиллиб, — Потому мы решили остановиться на верблюдах».

Оказалось, что в российских условиях самое доступное животное — это двугорбый верблюд, который используется в сельском хозяйстве в Астраханской области и в Казахстане. Более мелких и, по-видимому, более удобных в содержании представителей семейства Верблюдовые, альпак, в России нет как класса, а привезти их сюда слишком дорогое удовольствие.

«Двугорбые верблюды — наше всё, — смеётся исследователь, — Более того, они годятся для нашего климата. Их шерсть в длину зимой достигает примерно 40 сантиметров, и они спокойно выдерживают под открытым небом до 30 градусов мороза».

Поместили двугорбых красавцев возле Черноголовки на экспериментальную базу Института проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова, где за ними ухаживают профессиональные зоологи. Кстати, организация работ с животными, по словам учёных, стала самой сложной частью исследования. Прежде всего, потому что верблюдов надо было разместить таким образом, чтобы с одной стороны, иметь возможность контролировать все процедуры от начала иммунизации животного до финального забора крови, а с другой — обеспечить братьям нашим меньшим комфортное проживание. «Нам это удаётся уже в течение шести лет, — с гордостью рассказывает г-н Тиллиб, — На самом деле сложность организации работ с животными останавливает очень многих исследователей, которые могли бы составить нам конкуренцию в данной области. Видимо, поэтому конкурентов у нас в России пока нет».

«Двугорбые верблюды — наше всё. Они спокойно выдерживают под открытым небом до 30 градусов мороза». Чоня (самка, 7 лет) и Ждан (самец, 4 года) — основные поставщики наноантител

«Волшебные нанопули» российского производства

За рубежом пока тоже нет большой конкуренции в этой совсем новой области. Основным патентообладателем данной технологии является бельгийская биофармацевтическая компания Ablynx, которая ведёт широкомасштабную работу совместно с рядом известных фармкомпаний по получению и клиническим испытаниям новых лекарств на основе наноантител. Однако пока в продаже нет ни одного такого препарата. «Технология наноантител явно работает, что подтверждает также и наблюдающийся в последние пару лет рост интереса к этой технологии крупнейших фарм-производителей (Boehringer Ingelheim, Merck Serono, Novartis, Wyeth), которые расширяют совместные программы с фирмой Ablynx », — замечает Сергей Тиллиб.

Один из многих конкретных путей приложения данной технологии — получение наноантител, блокирующих неоангиогенез — патологический рост новых кровеносных сосудов в отсутствие очевидной потребности со стороны организма, что становится причиной многих тяжёлых заболеваний. Скажем, неконтролируемый рост новых кровеносных сосудов в сетчатке глаза вызывает нарушение проведения зрительных сигналов, что ведёт к слепоте. Другим примером патологического неоангиогенеза является формирование новых кровеносных сосудов в злокачественных опухолях. Если же заблокировать рост сосудов, то развитие опухоли останавливается. И наиболее эффективной стратегией контроля за нежелательным неоангиогенезом при различных патологиях (сосудистая дегенерация сетчатки, эндометриоз и злокачественные опухоли) является создание блокаторов фактора роста эндотелия сосудов (ФРЭС).

Сегодня на рынке РФ представлены два фармакологичских препарата, действие которых основано на подавлении активности ФРЭС. «Авастин» (бевацизумаб) производства швейцарской компании Roche представляет собой гуманизированное моноклональное антитело к ФРЭС и применяется для блокирования роста кровеносных сосудов в опухоли, тем самым тормозя ее развитие. «Люцентис» (ранибизумаб) производства компании Novartis является фрагментом того же гуманизированного моноклонального антитела и используется при лечении сосудистой формы возрастной дистрофии сетчатки. Однако основным недостатком данных препаратов, снижающим возможности их использования в нашей стране, является высокая цена.

«Лучше иметь свои аналоги, которые могут быть дешевле, а значит, и более доступны для более широких слоев населения, — рассуждает г-н Тиллиб, — В том числе и эту задачу мы решали в рамках нашего проекта «Создание наноантител для эффективного контроля за патологическим неоангиогенезом, индуцированным фактором роста эндотелия сосудов». Целью данного исследования являлось получение наноантител, блокирующих физиологические функции ФРЭС, для того, чтобы в будущем на их основе создать фармакологическую субстанцию и лекарственный препарат для лечения сосудистой формы дистрофии сетчатки и предотвращения роста новых кровеносных сосудов при раковых опухолях.

Проект осуществлялся под общим руководством  академика Георгия Георгиева. Помимо группы Сергея Тиллиба в работе приняли участие учёные и из других подразделений Института биологии гена РАН — сотрудники лабораторий Игоря Коробко и Сергея Ларина, а также сотрудники Российского государственного медицинского университета, который выступал в качестве организации-соисполнителя. Если исследовательская группа Тиллиба была ответственна за саму технологию генерирования наноантител, то в лабораториях Коробко и Ларина был проклонирован рекомбинантный белок ФРЭС, который был использован как для иммунизации верблюдов, так и для последующей селекции и анализа наноантител, а также были налажены и использованы тест-системы, позволяющие тестировать специфическую биологическую активность как рекомбинантного белка ФРЭС, так и отбираемых наноантител. Итогом же почти двухлетней работы стали два запатентованных наноантитела, которые по результирующей активности показали себя как наиболее успешные.

«Сейчас, когда финансирование нашего проекта по линии Роснауки закончилось, мы продолжаем вести работу — хотим ещё больше повысить активность полученных наноантител: оптимизируем их структуру (путём введения дополнительных точечных нуклеотидных замен), пытаемся получать их производные (димеры), попробуем улучшить свойства связывания и эффективности действия. По крайней мере, мы надеемся по эффективности приблизиться, а может, и превзойти “Авастин”, — замечает Сергей Тиллиб, — Тогда на основе этих разработок мы сможем претендовать на получение государственных средств на этапе НИОКРа. А потом уже на основе этого можно будет разработать конкретный препарат для клинических испытаний. А это значит, что уже через несколько лет у нас в стране может появиться свой, и возможно более эффективный аналог “Авастина”».